1、測試細胞類型
在選擇儀器之前,我們首先要思考兩個問題:
1、自己的細胞房培養(yǎng)哪些細胞?
一般實驗室細胞房培養(yǎng)的大多為常規(guī)傳代培養(yǎng)的細胞系,比如腫瘤細胞、動物哺乳細胞、昆蟲細胞等,這類細胞直徑范圍在5-40μm。
還有一些可能是從組織或血液分離的原代細胞,比如脾細胞、PBMC細胞、臍帶血或骨髓源的原代間充質(zhì)干細胞等;這類細胞組分復雜,可能有組織碎片、血小板、紅細胞等雜質(zhì)干擾 。
最后呢,還有一些老師在某些細分領(lǐng)域計數(shù)需求,比如酵母細胞(2-6μm)、T細胞(6-10μm)球藻細胞、芽孢桿菌等微生物小粒徑細胞(1-10μm),甚至低于1μm 的大腸桿菌 。
我們根據(jù)培養(yǎng)細胞類型的直徑大小,第一步要確認合適的物鏡放大倍數(shù),就跟在顯微鏡下有4X、10X、40X和100X不同放大倍數(shù)一樣,需要選擇一個正確的物鏡來滿足成像清晰和識別。正常的細胞系和原代細胞計數(shù)儀采用5X物鏡光學放大就可滿足,針對酵母和球藻以及一些粒徑更小的微生物樣本,需要用到10X甚至20X物鏡才能夠看的清晰。
2、細胞分析是關(guān)注細胞活率還只是細胞濃度?
細胞計數(shù)儀分為明場款(激發(fā)光為白光)和熒光款(不同顏色的激發(fā)光),其中明場包括非臺盼藍染色和臺盼藍染色,如果您平時只關(guān)注細胞濃度,這時選一款明場計數(shù)儀即可滿足需求。那如果細胞濃度和細胞活率都關(guān)注,我們就需要考慮用經(jīng)典臺盼藍染色還是AO(吖啶橙)/PI(碘化丙啶)雙熒光染色分析。
臺盼藍和熒光染色比較
臺盼藍染色 | AO/PI熒光染色 | |
原理 | 細胞膜的通透性 (非特異性染色) | 核酸染色 (特異性染色) |
識別區(qū)分 | 活細胞:不染色 死細胞:藍色 | 活細胞:綠熒光 死細胞:紅熒光 |
適用范圍 | 常規(guī)傳代培養(yǎng)細胞 | 細胞系、原代細胞、免疫細胞等 |
當然,除了臺盼藍和AO/PI雙熒光染色之外,還可以通過AO/DAPI染色,DAPI染色可以標記所有細胞核,可能在特定條件下染色死細胞。PI相比DAPI染死細胞則更為專一,用于標記失去膜完整性的死細胞。針對細菌的活率分析,還可以通過SYTO-9/PI染色,SYTO-9是一種能夠透過細胞膜的綠色熒光核酸染料,可用于細菌的RNA和DNA染色。
2、測試數(shù)據(jù)的可靠性
在完成第一步選擇后,接下來需要選擇一個檢測數(shù)據(jù)可靠的計數(shù)儀,無論它功能多么強大,數(shù)據(jù)可靠性是關(guān)鍵的,它主要體現(xiàn)在測試數(shù)據(jù)的準確性和穩(wěn)定性。
其中準確性是測試值與真實值之間的差異,我們一方面可以通過與人工血球計數(shù)對比,相同的一管細胞樣本,通常要求計數(shù)儀與人工之間的計數(shù)誤差在10%以內(nèi);另一方面可以用標準品(不同濃度、直徑和活率的標準品)進行驗證;要求更高的用戶會請第三方計量公司進行再次計量驗證,最后結(jié)合自己的細胞進行方法學驗證,通過以上多重驗證,最后確定儀器的準確性 。
其次,穩(wěn)定性通常我們可以對同一個樣品進行幾組平行測試,或者對同一個高濃度樣品做梯度稀釋分析線性關(guān)系,這里面有一個重要的參數(shù)CV值(變異系數(shù)),一個可靠的計數(shù)儀,在合適的濃度范圍內(nèi),通常CV值<5%。
決定一個計數(shù)儀數(shù)據(jù)可靠性,主要有以下兩個方面:
硬件 包括光路系統(tǒng)、成像系統(tǒng),其中成像的像素決定圖片的清晰度,從而影響到識別結(jié)果;配置越高,成像越清晰;其次是自動化過程,這里面包括進樣、對焦、曝光等參數(shù),全自動過程能減少人為操作帶來的誤差,從而提高檢測數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性,
軟件算法 在獲得一張高質(zhì)量圖片之后,要對其進行算法識別分析,目前主要基于兩種算法,一種是基于灰度值(普通算法),另外一種是基于深度學習人工智能算法(AI算法),這種先進算法相對于普通算法,能夠?qū)蹐F細胞精準分割,對不規(guī)則細胞精準識別,對含有細胞碎片、雜質(zhì)等復雜樣本精確計數(shù),這種算法能夠?qū)崿F(xiàn)不同領(lǐng)域、不用應(yīng)用場景的計數(shù)分析。萌薇生物也是國內(nèi)早期將AI技術(shù)應(yīng)用在細胞計數(shù)領(lǐng)域并進行儀器開發(fā)的廠家。
3、檢測效率
傳統(tǒng)的血球計數(shù)法能夠不斷被智能細胞計數(shù)儀替代,其中檢測效率是一個非常大的因素,如果您每天檢測的細胞樣本量多,檢測效率相當關(guān)鍵,一個優(yōu)秀的計數(shù)儀,不僅準和穩(wěn),快也很重要。檢測效率主要包括以下兩點:
單個樣品檢測時間:通常檢測一個樣品,人工計數(shù)時間在3-5分鐘,計數(shù)儀在10秒到2分鐘時間不等,產(chǎn)生差異的原因主要是儀器的自動化程度,尤其是手動進樣和手動調(diào)焦會直接影響到計數(shù)的效率,其次是算法分析的時間也有差異,例如先進的AI算法將直接縮短處理圖片的時間,這也是為什么萌薇計數(shù)儀實現(xiàn)測試分析速度快的重要原因。
計數(shù)板通量:一塊血球計數(shù)板有兩個加樣孔槽,市面上絕大數(shù)計數(shù)儀也是采用兩個通量,當我們樣本量比較多時,就需要更高通量的計數(shù)板,一次性可以同時測多少樣品,這也是決定效率的一個因素。
4、其他因素
除了以上三點以外,還有一些其他因素也得考慮:
機型--分體機還是一體機,主要根據(jù)細胞房空間大小來選擇,分體機需要連接電腦,一體機則包含顯示屏,可直接操作,相對分體機價格要高一些,但使用起來簡單方便。
軟件分析功能--一臺優(yōu)秀的計數(shù)儀在完成基本的參數(shù)(細胞濃度、活率、直徑、圓度、聚團率)分析功能之后,還要具備對測試數(shù)據(jù)的整理和分析,包括直徑分布圖、測試數(shù)據(jù)再分析、數(shù)據(jù)對比分析(CV值計算)、增殖曲線等分析功能;滿足JPG、EXCEL、PDF等多種格式的數(shù)據(jù)輸出方式,不僅能通過U盤輸出還可以通過服務(wù)器輸出;數(shù)據(jù)的備份和恢復也是必要的,保障用戶的數(shù)據(jù);除此之外,稀釋計算器和傳代計算器會讓您的實驗變得更加簡單。
性價比--硬件配置高,軟件分析功能強大,技術(shù)參數(shù)優(yōu)秀的計數(shù)儀往往相比于低配置的參數(shù)價格高一些,但不能一味追求低價,讓數(shù)據(jù)準確性和精確性沒了保障,甚至反而影響我們的實驗進度,最后可能面臨重新選擇。所有小薇經(jīng)常在一些用戶細胞房會發(fā)現(xiàn)在吃灰的低端計數(shù)儀,面對這些價格低的儀器選擇要慎重!
服務(wù)--這里包括售前售后服務(wù)、試用培訓、技術(shù)支持,3Q驗證服務(wù),以及儀器的質(zhì)保期。